Probamos los aceites esenciales frente a las bacterias patógenas de plantas

Los aceites esenciales se han revelado como potentes agentes antimicrobianos. Nuestros experimentos anteriores usando como bacterias de prueba a Bacillus megaterium y Escherichia coli nos ha mostrado que no todos tienen el mismo efecto y que incluso su potencial inhibidor del crecimiento varía entre ambos microorganismos.

Hemos probado la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales frente a las bacterias patógenas de plantas con las que hemos ensayado los extractos vegetales. Se trata de Xanthomonas campestris (Xc),  Pseudomonas syringae (Ps) y Dickeya dadantii (Dd). Las imágenes con los resultados se muestran debajo. Valoraremos la actividad antimicrobiana como en el caso de los extractos, midiendo el diámetro de los halos, calculando su superficie y restando la superficie del disco de papel impregnado con el aceite esencial (los discos que usamos miden 6 mm de diámetro). Estos provienen de romero, pachuli, hisopo, mejorana, palmarosa, ajedrea, ravintsara, geranio, salvia española, lavandín, bergamota, menta, tomillo, enebro y espliego.

Hemos ensayado también la actividad antimicrobiana de otros aceites esenciales que había en el laboratorio desde hace mucho tiempo. Se trata de tomillo carrasqueño, lavandín, romero, petitgrain, salvia española, nerobi, geranio, anís y tomillo.

¿Qué conclusiones podemos obtener a partir de nuestros resultados? Si revisamos los resultados que obtuvimos con nuestras bacterias de prueba, ¿coinciden los resultados en los aceites que se repiten? ¿A qué se pueden deber las diferencias que observamos? ¿Se ha descrito en la bibliografía una actividad antimicrobiana como la que observamos en estos aceites esenciales? Como veis, los resultados nos aclaran algunas preguntas pero siempre nos llevan a otras. Así es la ciencia; eso demuestra que vamos por el buen camino. Esperamos vuestros comentarios.

Ensayamos nuestros extractos frente a bacterias patógenas vegetales

A lo largo de estas  semanas hemos estado obteniendo nuevos extractos vegetales. En  algunos casos lo hemos hecho triturando la planta en presencia de etanol al 70%; en otros hemos macerado las muestras secas en el mismo disolvente durante 48 horas y después hemos triturado. El pasado miércoles ensayamos su actividad ante nuestras bacterias de prueba, Bacillus megaterium y Escherichia coli. Los resultados se pueden leer en las siguientes imágenes.

Pero además, ensayamos la actividad frente a tres bacterias patógenas de plantas. Se trata de Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae y Dickeya dadantii. Es importante que conozcamos a nuestras bacterias de prueba. Algunos de vosotros podéis buscar información sobre ellas y hacer un breve comentario en esta misma entrada del blog. Cuando tengamos que preparar nuestro artículo y presentar nuestros resultados tendremos trabajo adelantado.

Volviendo a nuestra investigación, los resultados que obtuvimos los podemos ver en las imágenes de abajo. Las fotografías están editadas modificando el brillo y el contraste para hacer más patentes los halos y facilitar su interpretación.

Es ahora el momento de obtener nuestros resultados. Para valorar la actividad antimicrobiana vamos a medir el diámetro de los halos de inhibición y vamos a calcular su superficie; a ella le restaremos la superficie del disco que impregna los extractos (miden 6 mm de diámetro); así tendremos un cálculo de la zona donde no han crecido las bacterias. Es recomendable que cada placa sea medida por varias personas para después poder calcular los valores medios y reducir los errores. Compartiremos nuestras medidas en los comentarios del blog. En el caso de que alguien no hubiese podido medir las placas se puede hacer sobre las mismas imágenes sabiendo el diámetro de los discos de papel y haciendo la proporción adecuada.

Pero también es momento para valorar nuestros resultados e ir sacando nuestras conclusiones. ¿Qué extractos afectan en general a todas las plantas? ¿Cuáles, por el contrario, solo afectan a alguna en particular? ¿Qué aspectos podemos mejorar de nuestros experimentos? ¿¿Cuáles pueden ser nuestras actuaciones de aquí en adelante? Además de las notas que cada uno debe tomar sobre los resultados del proyecto es bueno que compartamos nuestras ideas en los comentarios.

Conocemos más sobre antibióticos con Sonia Anaya

Dentro de las actividades que llevamos a cabo para nuestro proyecto sobre antimicrobianos, esta mañana hemos recibido en nuestro laboratorio a Sonia Anaya Ordóñez, farmacéutica del distrito sanitario Granada-Metropolitano y experta en el uso de antibióticos.

Nos ha hablado de la importancia de las bacterias en nuestro organismo y de cómo la microbiota es una parte importante del mismo. Se trata de una gran cantidad de microorganismos necesarios para que nuestro cuerpo funcione adecuadamente; sin embargo, en ocasiones alguno de ellos se vuelve patógeno, da lugar a una infección y para eliminarlo es necesario el uso de antibióticos.

Descubiertos accidentalmente por Fleming, los antibióticos curan las infecciones. Sin embargo, no todos son eficaces para todas las bacterias; cada uno tiene su espectro de acción. Y también tienen efectos secundarios pues a la hora de actuar no distinguen bacterias patógenas de aquellas que nos resultan beneficiosas. En ocasiones, pueden dar lugar a problemas muy serios, como las reacciones anafilácticas.

El problema más importante que se desprende del uso de los antibióticos es la aparición de resistencias, es decir, la aparición de mecanismos moleculares por los que las bacterias se vuelven insensibles a los mismos. El uso indiscriminado e inadecuado de los antibióticos es el principal factor que favorece que se seleccionen bacterias resistentes a estos fármacos. La importancia de este problema se manifiesta en el hecho de que cada vez transcurre menos tiempo desde que se descubre un nuevo antibiótico y aparecen bacterias resistentes al mismo. Y el hecho de que las bacterias tengan mecanismos por los que intercambian material genético hace que una cepa en particular pueda hacerse resistente a un número cada vez mayor de antibióticos. Y esto es un problema importantísimo pues cada vez hay menos antibióticos que resulten efectivos frente a estas superbacterias.

Como nos ha comentado Sonia, el principal problema que ha llevado a la aparición de estos microorganismos multirresistentes ha sido el uso indiscriminado e inadecuado de los antibióticos. Por ejemplo, cuando se prescriben para el tratamiento de infecciones víricas o cuando no se siguen las pautas terapéuticas adecuadamente.

Actualmente mueren unas 700.000 personas en el mundo cada año porque no hay antibióticos con que tratar las infecciones que padecen. En España mueren unas 3.000. Para 2050 se espera que se produzcan 10.000.000 millones de muertes debido a la resistencia a los antibióticos.

Quizá ante este panorama nuestro proyecto adquiera un nuevo sentido. Nos puede dar una idea de la importancia de la investigación en nuevos productos para controlar a los microorganismos, en nuestro caso, procedentes de plantas o incluso de otras bacterias. Por otro lado, cuando vemos las interacciones que se producen entre microorganismos, vemos que ellos mismos desarrollan mecanismos que controlan el crecimiento de estirpes competidoras; quizá veamos en ello, que eliminar indiscriminadamente microorganismos puede dar lugar a problemas ocasionados por alterar el equilibrio que los mismos microorganismos tienen en la naturaleza, algo que hacemos cuando consumimos antibióticos sin necesidad.

Es ahora momento de pensar sobre todo cuanto estamos aprendiendo y de compartir nuestras reflexiones sobre el proyecto. ¿Qué opináis? ¿Qué sugerencias tenéis? ¿Qué nos aporta la charla de hoy a nuestro proyecto? Esperamos vuestros comentarios.

Nuestros primeros ensayos con aceites esenciales

Los aceites esenciales son las sustancias aromáticas responsables del olor de las plantas. Son sintetizadas y segregadas por determinadas estructuras de la planta, como células oleíferas, cavidades secretoras, pelos glandulosos, o tejidos específicos como la corteza de los cítricos, pétalos de las rosas, etc. Están muy extendidas en la naturaleza y son abundantes en las labiadas, coníferas y compuestas. Constituyen una fracción muy pequeña del peso seco de la planta, normalmente entre el 0,1 y el 1% y son insolubles en agua y solubles en alcoholes y disolventes orgánicos. Químicamente, suelen ser una mezcla compleja de sustancias de diverso tipo, principalmente terpenos, unos lípidos insaponificables derivados de un compuesto denominado isopreno. Se pueden obtener por distintos métodos; el más frecuente es la destilación por arrastre de vapor.

Desde un punto de vista farmacológico, sus propiedades son muy variadas dada la heterogeneidad de moléculas que los componen. En relación a nuestro proyecto -dado que buscamos sustancias con efecto antimicrobiano de origen vegetal- son interesantes porque tienen un importante poder antiséptico que se manifiesta frente a un gran número de bacterias, incluso frente a cepas resistentes a antibióticos. Algunos son activos frente a las levaduras, hongos unicelulares. En cuanto a su aplicación en las personas hay que tener en cuenta que, a pesar de ser considerados productos naturales, algunos de ellos pueden causar daños por sobredosificación.

Además de ensayar el efecto antimicrobiano de determinados extractos vegetales, nos hemos planteado para nuestro proyecto estudiar los efectos de los aceites esenciales sobre los microorganismos. Para ello hemos adquirido quince de ellos. Son los procedentes de las siguientes plantas: ajedrea (Satureja montana), lavandin (Lavandula hybrida), espliego (Lavandula latifolia), romero (Rosmarinus officinalis), bergamota (Citrus bergamia), salvia española (Salvia lavandulifolia), enebro (Juniperus communis), geranio (Pelargonium graveolens), tomillo (Thymus zygis)), menta (Mentha piperita), pachuli (Pogostemon cablin), palmarosa (Cymbopogon martinii), mejorana (Thymus mastichina), ravintsara (Citrus cinnamomum) e hisopo (Hyssopus officinalis). Sería interesante para nuestro proyecto ver si se ha descrito para estos mismos aceites actividad antimicrobiana. ¿Qué tal si cada uno de vosotros elige uno e indaga en la bibliografía? Ya sabéis... Google Académico nos proporciona respuestas bibliográficas. 

Hemos hecho un primer ensayo frente a nuestras bacterias Escherichia coli y Bacillus megaterium. Las imágenes de debajo muestran los resultados. Es posible que las placas con Bacillus megaterium tengan alguna otra bacteria que haya contaminado el cultivo del cual la tomamos para inocular en el agar semisólido. En cualquier caso nos permite hacer una valoración previa de la actividad de los mismos.

¿Qué conclusiones podemos sacar del estudio de las placas? ¿Tienen todos los aceites esenciales el mismo poder antiséptico frente a nuestras bacterias de prueba? ¿Qué nuevos experimentos podemos plantear con estas sustancias?

Os dejo unas referencias generales sobre los aceites esenciales, de la primera he sacado la mayor parte de la información de este texto. Es importante para incluirlas en la bibliografía del trabajo final.

Los aceites esenciales. Aplicaciones farmacológicas, cosméticas y alimentarias.
Aceites esenciales: conceptos básicos y actividad microbiana.

Antimicrobianos bacterianos

Este curso dedicamos nuestros proyectos a la búsqueda de antimicrobianos. En las páginas de este blog se pueden ver nuestros avances en la detección de posibles efectos inhibidores del crecimiento de extractos vegetales y de aceites esenciales de procedencia vegetal. Pero además de las plantas, tanto los hongos como otros microorganismos son capaces de producir este tipo de sustancias.

Las bacterias también producen antibióticos. La estreptomicina o la bacitracina son ejemplos de sustancias de un amplio espectro que resultan activas frente a microorganismos de otras especies. En otras ocasiones el efecto se ejerce únicamente sobre cepas de la misma especie o especies muy próximas; en este caso hablamos de bacteriocinas. Igualmente pueden producir otros tipos de compuestos, como ácidos o agua oxigenada, que también pueden llegar a inhibir el crecimiento de otras bacterias.

Como complemento al proyecto de antimicrobianos vegetales nos hemos planteado identificar algunas bacterias productoras de sustancias inhibidoras del crecimiento. Nuestro punto de partida han sido muestras de suelo procedentes del huerto de nuestro instituto junto a otras proporcionadas por nuestro alumnado de segundo de bachillerato tomadas en distintas localidades como Cenes, Melegís, Restábal o Churriana de la Vega. Otras muestras han sido tomadas de hojas de diversos árboles. 

Suspendimos el suelo en suero fisiológico estéril y diseminamos en placa para obtener colonias aisladas. Las hojas, bien se colocaron directamente sobre el agar de las placas de Petri o se suspendieron en suero fisiológico y se extendieron sobre las mismas. Una vez crecidas, se tomaron muestras de las colonias aisladas y se llevaron a nuevas placas, identificándose con un código que recordase su procedencia. Para todos nuestros experimentos hemos utilizado el medio de cultivo TSA (agar de soja y tripticaseína). Algunas de las placas originales se pueden ver en la imagen de arriba.

Con las bacterias aisladas se inocularon nuevos cultivos en placa, de modo que las colonias creciesen regularmente repartidas en éstas. Se incubaron y se ensayó la actividad antibacteriana frente a la bacteria gram positiva Bacillus megaterium y la gram negativa Escherichia coli. 

Para ello se inocularon tubos que contenían  5 ml de agar semisólido (medio TSB + agar al 0,6%) a una temperatura en torno a los 42-45 ºC  con 100 microlitros de cultivos de ambos microorganismos. Inmediatamente se vertía el contenido de los mismos asegurándose de que cubría por completo a todas las colonias. El objetivo era el crecimiento en césped de las bacterias de prueba sobre el agar de la placa. Los cultivos se incubaban en la estufa a  28ºC.

La presencia de actividad antimicrobiana se detecta por la aparición de halos de inhibición alrededor de las colonias, es decir, de zonas en las que las bacterias de prueba o no crecen o lo hacen con dificultad.

Las imágenes muestran las primeras placas con nuestros resultados. Las dos primeras las hemos obtenido en nuestro laboratorio; la tercera corresponde a aislados que ha hecho Manuel Espinosa en la Estación Experimental del Zaidín a partir de unas placas que se nos contaminaron. En cualquier caso comprenden casi la totalidad de nuestros aislados. En estas placas se puede apreciar cómo algunos microorganismos inhiben el crecimiento de las bacterias de prueba. ¿En cuáles se aprecia actividad antimicrobiana? 

Nuestro propósito ahora es identificar y conocer cómo son algunos de estos microorganismos. Esta fase del proyecto la llevaremos a cabo en la Estación Experimental del Zaidín y para ello utilizaremos técnicas de análisis de ADN. Pero antes de ello debemos elegir a nuestros mejores candidatos, que deben ser quienes más actividad muestren frente a las bacterias de prueba.

Y ahora es momento de plantear algunas preguntas. ¿Cómo podemos dar una medida de la actividad antibacteriana que nos permita comparar a nuestros microorganismos? ¿Qué criterios deben cumplir las cepas que seleccionemos? ¿Cómo debemos trabajar? ¿Qué microorganismo o microorganismos proponéis para nuestros estudios posteriores? ¿Qué sugerencias proponéis para completar nuestro proyecto? Compartamos nuestras respuestas en los comentarios.

Nuevos experimentos con granada y aceites esenciales

Continundo con nuestros experimentos hemos probado la actividad antibacteriana de la granada (Punica granatum), tanto de la corteza como del fruto de la misma. Para la corteza, y según se describe en la bibliografía, hemos usado distintos procedimientos. Por un lado hemos hecho cocimientos de corteza seca y de corteza fresca y, al igual que con el resto de las plantas, hemos hecho una extracción con etanol al 70%, concretamente macerando durante dos días 2 gramos de corteza en 10 ml de solución de etanol. Hemos probado la actividad del zumo fresco filtrado, sin filtrar y de los restos del filtrado en etanol al 70%. Los resultados se muestran en la imagen 1.

Algo muy descrito en la bibliografía es el poder bactericida de los aceites esenciales de plantas. Estos contienen una gran cantidad de productos activos que les dota de un importante carácter antimicrobiano. Estos compuestos resultan últimamente de especial interés pues se está valorando su uso en la ganadería para evitar dar antibióticos convencionales al ganado. De hecho hay un grupo de trabajo en la Estación Experimental del Zaidín que investiga en este sentido. Pues bien, en nuestro laboratorio disponemos de muestras de aceites esenciales. Llevan mucho tiempo aquí pero hemos querido valorar si aún eran capaces de inhibir el crecimiemto de nuestras bacterias. Se trata de aceites esenciales de romero, salvia, lavandín, tomillo, anís, geranio, árbol del te, petitgrain y tomillo carraqueño.

En la imagen 2 se muestra la acción de éstos sobre Escherichia coli y Bacillus megaterium. Se ha manipulado el brillo y el contraste de las imágenes -especialmente en el caso de E. coli- para favorececer la detección en las fotos de los halos de inhibición.

Toca ahora hacer una valoración de nuestros resultados. ¿Afectan los aceites esenciales por igual a ambos microorganismos? Aunque el experimento era simplemente para valorar la actividad ¿son todos iguales de activos? ¿cuál o cuáles presenta más actividad? 

Sería interesante que nos documentáramos sobre el papel antimicrobiano de los aceites esenciales. Ver qué dice la bibliografía sobre ellos, cuáles son sus principios activos, cuáles son los que presentan más actividad, qué uso tienen... ¿Que otras cosas podríamos investigar en relación a éstos para nuestro proyecto? Vuestras ideas valen muchísimo más de lo que vosotros mismos os creéis. Espero vuestros comentarios.

Proyecto Antimicrobianos vegetales. Primeros resultados

En la última sesión dedicada al proyecto ensayamos la posible actividad antimicrobiana de doce extractos de plantas frente a Bacillus megaterium y Escherichia coli. Recordemos que para ello inoculábamos 100 microlitros de un cultivo líquido de estas bacterias en 5 ml de agar semisólido (TSB + agar 0,6%) y lo depositábamos sobre placas con medio TSA. Con ello conseguiríamos un crecimiento en césped sobre toda la placa, es decir, los microorganismos formarían una capa continua sobre el agar.  Una vez hecho lo anterior,  disponíamos los discos de papel impregnado en los extractos vegetales obtenidos tal y como indicábamos en la entrada anterior.

Los resultados los podemos ver en la imagen que se adjunta. Para extraer las conclusiones oportunas debemos estudiar con cuidado el crecimiento bacteriano en la proximidad de los distintos discos y observar diferencias entre ellos.

¿Hay algo llamativo en las placas? ¿Hemos encontrado algún efecto antimicrobiano en cualquiera de nuestros extractos? ¿En cuál o cuáles? ¿Cómo podríamos dar una medida de la actividad de los extractos de nuestras plantas? Esto último es importante para comparar la actividad de distintos extractos o en el caso de que ensayemos distintas concentraciones de los mismos.

En las sesiones de introducción al proyecto aprendimos cómo buscar información en bases de datos de publicaciones científicas. ¿Se ha descrito en la bibliografía actividad antimicrobiana en la planta o plantas con las que estamos trabajando? Para ello es importante tener en cuenta que es mejor que le preguntemos a la base de datos con el nombre científico de la planta. And not only in Spanish!

Como es habitual, aunque os lo recuerdo para los que os habéis incorporado en este curso al instituto, las respuestas a todas estas preguntas deben hacerse como comentarios a esta entrada del blog, aparte de en las notas de nuestros cuadernos. Es importante también incluir nuestras impresiones de los experimentos y nuevas propuestas que completen nuestro trabajo. Todo ello nos será útil para la elaboración del artículo final.