Uno de los proyectos que tenemos este año va dedicado a los pimientos. Se trata de estudiar las propiedades saludables que tiene esta hortaliza y para ello estudiaremos diversas variedades de pimientos: el dulce, el boiro (una variedad de pimiento de Padrón), el jalapeño verde, el chile rojo y el habanero rojo. Nuestros progresos se pueden ver en el blog ¿Sueñan los pimientos con la medicina?
Uno de los aspectos que nos hemos planteados es valorar si las variedades de pimientos que tenemos contienen sustancias inhibidoras del crecimiento de microorganismos. Tenemos experiencia en ello después de nuestros proyectos del curso anterior con los extractos vegetales y los aceites esenciales. Y la literatura nos dice que una de estas sustancias, la capsaicina -a la vez responsable del sabor picante de los pimientos- la tiene. Y puesto que teníamos pimientos con distinto grado de acrimonia, era de esperar que alguno de ellos tuviera esta propiedad. Utilizamos la técnica de la difusión en disco; como sabéis, consiste en impregnar discos de papel de filtro grueso con los extractos y colocarlos sobre placas de Petri inoculadas con un césped de una serie de bacterias de prueba.
Y nuestros experimentos dieron resultados negativos. No aparecieron halos de inhibición alrededor de los discos. Como tampoco observamos halos alrededor de los discos impregnados únicamente con etanol al 70%, el solvente que hemos usado para obtenerlos. Este era uno de nuestros controles. Si tampoco hubiese habido crecimiento alrededor de estos últimos, no hubiéramos podido saber si la capacidad antimicrobiana se debía a los extractos o al etanol. En cualquier caso, con estos resultados hubiésemos podido concluir que nuestros pimientos no contenían compuestos antimicrobianos o no en la concentración suficiente como para dar lugar a los halos. Y hubiéramos acabado ahí.
Si no fuese porque teníamos otro tipo de control.
Y este control era la propia capsaicina, la sustancia para la que se ha descrito carácter antimicrobiano en la litetratura. Paralelamente al experimento anterior estudiamos el carácter inhibidor de la capsaicina a una serie de concentraciones dadas y los resultados fueron... ¡igualmente negativos! Y habíamos ensayado concentraciones capaces de matar células humanas en cultivo, tal y como nos comentó José Manuel Palma en la sesión anterior. Las concentraciones ensayadas iban desde 10 micromolar a 1000 micromolar.
Pero ¿y si estas concentraciones eran demasiado bajas para detener el crecimiento de las bacterias? Era una posibilidad. Y la forma de comprobarlo era muy fácil: aumentar la concentración de capsaicina con la que impregnábamos los discos. Y probamos con concentraciones 50 veces superiores, desde 1,6 mM hasta 50 mM. ¡Y los resultados fueron igualmente negativos! La falta de halos de inhibición se puede ver en la imagen de abajo.
¿Sería un problema del diseño experimental? ¿De la forma de preparar las placas? ¿De si las bacterias que utilizamos son realmente buenas indicadoras? Paralelamente llevamos a cabo experimentos similares, con la misma metodología, con extractos de cáscara de granada. Como mostrábamos en el blog del proyecto y en la imagen de abajo, se observaban halos de inhibición notorios frente a todas las bacterias ensayadas. No debía ser un problema del protocolo empleado con los extractos de pimiento.
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Halos de inhibición de extractos de granada sobre un cultivo de Escherichia coli. Control con los disolventes empleados para la extracción.
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No obstante, decidimos cambiar la técnica. Ahora íbamos a probar la difusión en pocillo. Para ello, perforábamos y extraíamos un disco de agar de la placa inoculada con las bacterias, creando un pocillo en el depositábamos el volumen apropiado de extracto de pimiento e igualmente de capsaicina, ésta a una elevada concentración, 50 mM.
¡Y de nuevo hemos obtenido resultados negativos! Salvo un halo de inhibición que ha aparecido frente a Xanthomonas con el extracto de pimiento de la variedad Boiro, el resto de los extractos no muestra actividad, ni tampoco la capsaicina. ¿Y por qué aparece solo ante esta bacteria?
Como podemos ver, los misterios no son solo cosa de las novelas de intriga o de las películas. Nos enfrentamos a un auténtico misterio. ¿Por qué no observamos halos de inhibición con la capsaicina con ninguna de las técnicas que utilizamos? ¿Por qué ha desaparecido el efecto antimicrobiano de la capsaicina? Hay varias posibles explicaciones. Paula, una de las participantes en el proyecto, aportó una referencia bibliográfica en la que una cepa de la bacteria Xanthomonas era infectiva en un pimiento con alto grado de acrimonia y, por tanto, era de suponer que resistía a la capsaicina. Este tipo de resistencias se dan, pero no son demasiado frecuentes. ¿Vamos a tener cinco microorganismos resistentes simultáneamente a la capsaicina? Es muy poco probable. ¿Hemos alterado la capsaicina eliminado su actividad antimicrobiana? Podría ser ¿pero por qué los extractos de las variedades con más capsaicina tampoco dan halos de inhibición? Y así podríamos seguir haciéndonos más preguntas.
Como vemos, la ciencia nos aclara cosas pero a la vez nos despierta nuevos interrogantes. Si no surgieran éstos, probablemente no estaríamos participando del proceso científico a fondo, ni la humanidad hubiera avanzado tanto en la lucha contra las enfermedades ni en el desarrollo tecnológico. Y así las cosas, es ahora momento de emular al detective más famoso del mundo par resolver este auténtico misterio. Y al igual que él, no nos queda más remedio que recurrir a la ciencia. Como decía Sherlock Holmes: "Una vez descartado lo imposible, lo que queda, por improbable que parezca, debe ser la verdad". Pero con eso no bastará, tendremos que comprobarlo. Como hemos hecho con la capsaicina.
