Primeros experimentos con las bacterias y la música

Hemos comenzado la parte netamente experimental de nuestro proyecto ensayando el efecto de un determinado sonido sobre el crecimiento de las bacterias. Para ello hemos elegido el sonido grabado por Irene con su violonchelo. La nota mantenida es un La, a una frecuencia de 220 Hz.  El procedimiento ha sido el siguiente.

En la sesión de ayer preparamos cultivos líquidos de las tres bacterias que vamos a estudiar. Esta mañana, una vez crecidos, hemos inoculado matraces con 20 mililitros de medio de cultivo líquido TSB (caldo de triptona de soja y caseína) con 0,5 ml de cultivos en fase estacionaria crecidos desde el día antes. Se han dividido en dos lotes, uno de ellos se ha incubado a 37ºC en una estufa, en cuyo anterior se ha situado un altavoz conectado vía bluetooth a un ordenador desde el que se repetía la nota emitida en bucle con una intensidad de sonido de unos 60 dB. En el segundo, el experimento control, se han incubado los matraces a la misma temperatura, en este caso sin sonido. Se han tomado muestras iniciales y a la hora, dos horas, tres horas y cinco horas y se han hecho tres lecturas de densidad óptica o absorbancia de cada una de ellas en un espectrofotómetro Shimadzu, a una longitud de onda de 600 nm, calculándose después el valor medio. El experimento con E. coli se ha realizado por duplicado aunque los datos se han agrupado para los gráficos. Los valores medios de las lecturas para cada microorganismo, en presencia de sonido (rojo) o sin él (azul), se representan en las gráficas de abajo.

 

 

 

 

 Los datos numéricos se muestran en la tabla siguiente:

 

A partir de los datos numéricos podemos hacer cálculos interesantes que nos pueden permitir interpretar los resultados. Como hemos comentado antes, estamos estimando el crecimiento de los microorganismos midiendo la densidad óptica de los cultivos; esta es la absorción de luz que causa la suspensión de bacterias. La longitud de onda estándar para las bacterias es de 600 nm. 

El crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo sigue una curva sigmoide, con una fase de crecimiento exponencial en la que el cultivo duplica el número de células cada cierto intervalo de tiempo. A esta le sigue una etapa de transición hacia una fase estacionaria, en la que se mantiene el número de bacterias en el cultivo; a partir de ahí, y por agotamiento de los nutrientes, el número de bacterias decrece. A partir de las medidas de densidad óptica podemos valorar en qué estado se encuentra el crecimiento de nuestros microorganismos. Y para ello Manuel Espinosa nos propone usar esta aplicación

 https://punnettsquare.org/od-growth-calculator/

 Introduciremos las medidas de DO inicial y final y el intervalo de tiempo que transcurre entre estas dos medidas. Repetiremos estas medidas para todos los intervalos y compararemos los resultados. Nuestra valoración de todo lo anterior lo dejaremos como comentario a esta entrada del blog.

Aprendiendo las técnicas básicas microbiológicas

Este jueves hemos tenido una nueva sesión con nuestro investigador Manuel Espinosa. En esta ocasión nos ha proporcionado los microorganismos con los que vamos a trabajar. Estos son Escherichia coli W3110, Pseudomonas putida KT2440 y Stutzerimonas stutzeri MJL19. Con ellas las alumnas han aprendido a sembrar tanto en medio líquido como en placa de Petri y hemos preparado los cultivos para los próximos experimentos. Algunas de las imágenes de la sesión son las que se incluyen abajo.

Iniciamos nuestros experimentos: elegimos sonidos

El objetivo principal de este proyecto es estudiar posibles efectos de la música y el sonido sobre los microorganismos. Vamos a comenzar con lo más simple, y esto va a ser grabar una misma nota con los instrumentos que tocan nuestras jóvenes; éstos son clarinete, flauta, piano, violín y violonchelo. Con esas grabaciones intentaremos estimular a nuestros microorganismos, sometiendo a las bacterias de modo continuo a esos sonidos. Acordamos que el sonido mantenido se haría en la tonalidad de La, preferentemente con una frecuencia de 440 Hz adaptándose este tono a la idiosincrasia de cada instrumento. Las estudiantes han grabado con sus  móviles unos segundos y hemos estudiado las características de dicho sonido mediante la aplicación de software libre Sonic Visualiser. Los espectrogramas de sus sonidos son los siguientes:

Amplitud de sonido en el clarinete con la nota La.

Espectro de frecuencias para la nota La con el clarinete.

Amplitud de sonido en la flauta travesera con la nota La.

Espectro de frecuencias en la flauta travesera con la nota La.

Amplitud de sonido en el piano con la nota La.

Espectro de frecuencias en el piano con la nota La.

Amplitud de sonido en el violín con la nota La.

Espectro de frecuencias en el violín con la nota La.

Amplitud de sonido en el violonchelo con la nota La.

Espectro de frecuencias en el violonchelo con la nota La.

 

También hemos analizado una nota de la misma frecuencia pero obtenida con la aplicación AudioKit Synth One para Ipad.

Amplitud de sonido en el sintetizador con la nota La.

Espectro de frecuencias en el sintetizador con la nota La.

Un proyecto para nuestras estudiantes del conservatorio

¿Responden los microorganismos ante la música? Esta es la pregunta que nos hemos planteado para un nuevo proyecto desarrollado conjuntamente entre la Estación Experimental del Zaidín y el IES Zaidín Vergeles. Es sabido que los seres humanos, incluso los animales y también se ha dicho de las plantas, responden ante los estímulos sonoros. Sin embargo es escasa la investigación en el campo de la microbiología. 

Dado que tenemos en el instituto alumnas de los conservatorios de música Ángel Barrios y de danza Reina Sofía, se ha dado la situación ideal para plantear un proyecto encaminado a ver posibles efectos de la música sobre las bacterias. Este está dirigido por Manuel Espinosa, investigador de la EEZ-CSIC, busca que las jóvenes participantes establezcan vínculos entre la biología y la música a la vez que se desarrolla su competencia científica, abordando de manera práctica diversos contenidos de la asignatura de Biología de segundo de bachillerato.

Comenzamos con una primera sesión teórica en la que Manuel Espinosa habló de los efectos de la música de una perspectiva biológica, de cómo estimula diversas áreas cerebrales, y de conceptos básicos relacionados con la microbiología, estableciendo los principales objetivos y procedimientos a llevar a cabo en el proyecto. Estudiaremos posibles efectos del sonido sobre el crecimiento de los microorganismos, su capacidad de formar biopelículas y su movilidad. En el aspecto musical ensayaremos el efecto del sonido de distintos instrumentos o de fragmentos de obras de distintos periodos musicales, todos ellos interpretados por las alumnas participantes.

Manuel Espinosa Urgel (EEZ-CSIC) junto a las alumnas participantes en el proyecto.

¿Aceites esenciales de plantas como agentes antimicrobianos?

Cuando iniciábamos este proyectos nos planteábamos varios objetivos, uno de ellos era demostrar que el problema de la existencia de bacterias multirresistentes a antibióticos no es algo que nos pille de lejos, sino que en nuestro propio organismos podíamos encontrarlas. En nuestro diseño experimental hemos llevado a cabo una selección artificial a partir de muestras que nos hemos tomado, principalmente de la piel y de la boca, para cinco antibióticos. Hemos hecho ensayos hasta aislar bacterias resistentes a tres de ellos. ¿Qué hubiese pasado si hubiésemos ensayado un mayor número de antibióticos?

Dado que el problema de las superbacterias es que no hay antibióticos que les hagan frente, se hace necesario la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos. Dada nuestra experiencia en proyectos anteriores decidimos hacer ensayos con aceites esenciales.

El procedimiento ha sido el mismo que para los antibióticos. Hemos preparado placas de Petri con 20 ml de medio TSA sobre el que hemos añadido 5 ml de agar semisólido inoculado con las bacterias aisladas. Una vez solidificado el medio hemos dispuesto discos de papel Whatman sobre los que hemos depositado 5 µL de los aceites esenciales que se detallarán después. Los resultados se muestran en la tabla siguiente, en la que las dimensiones de los diámetros de los halos de inhibición vienen representados en milímetros.

 Los aceites esenciales ensayados son:

AT: árbol del te. ES: espliego. HI: hisopo. MJ: mejorana. GE: geranio. AJ: ajedrea. MN: menta. PA: palmarosa. BE: bergamota. LA: lavandín. TO: tomillo. RO: romero. RA: ravintsara. EN: enebro. SA: salvia.

En un primer análisis se puede observar cómo las cepas bacteriana de control son, en general, sensibles a la mayoría de los aceites esenciales ensayados.  En el caso de nuestras bacterias multirresistentes, se observa una mayor resistencia también a los aceites esenciales.

Los aceites esenciales no tienen todos la misma capacidad antimicrobiana. Destacan los de ajedrea y tomillo, activos frente a todas las cepas ensayadas. Los menos efectivos han resultado ser los de hisopo, bergamota y romero. 

Realizando antibiogramas

Como resultado del experimento anterior hemos obtenido tubos con cultivos en medio líquido en los que hay bacterias resistentes al menos a tres antibióticos. Aunque en algún caso hemos observado crecimiento en todos los tubos, no podemos estar seguros de que hay bacterias que sean resistentes a los cinco antibióticos ensayados simultáneamente, sino al menos a tres de ellos, los dos de partida y el añadido al tubo. Esto se justifica porque cuando aislamos bacterias, bien de la piel o de la boca, pueden ser de distintas especies y, dentro de estas, con distintas resistencias.

A partir de estos crecimientos en medio líquido hemos tomado muestras que hemos extendido en placas de Petri con la dilución apropiada para obtener colonias separadas. A partir de ahí hemos aislado algunas para someterlas a un antibiograma, un estudio en el que se verá, en medio sólido, la resistencia de una determinada cepa bacteriana a los distintos antibióticos ensayados. 

Para llevar a cabo un amtibiograma preparamos placas con 20 ml de medio de cultivo TSA. Sobre este se van a verter cinco mililitros del agar blando (TSB + agar 0,6%), inoculado con 100 µL de cultivo en medio líquido de la bacteria de prueba. Como control hemos ensayado dos cepas de la Colección Española de Cultivos Tipos, una de Escherichia coli (Gram negativa) y otra de Staphylococcus epidermidis (Gram positiva); cuya referencia se indican en las tablas. Una vez solidificado se han dispuesto sobre la superficie del medio discos de papel Whatman regularmente espaciados impregnados de los antibióticos a ensayar. Se han realizado dos ensayos, en ambos casos con los antibióticos que nos dio Manuel Espinosa (ver entrada anterior) a una dilución 1:200, de modo que la dilución en el medio de las placas fuese la misma que en el medio de cultivo líquidos de los primeros ensayos. En el primero se añadieron 5 µL de antibiótico mientras que en el segundo se dispusieron 10 µL.

En la denominación de nuestras cepas es importante señalar que los grupos de tres letras finales corresponden a las iniciales de los antibióticos a los que inicialmente presentaban resistencia. Por ejemplo, la cepa P2 ACK se aisló siendo seleccionada por su resistencia a Ampicilina, Cloramfenicol y Kanamicina. 

Los resultados se expresan en las tablas siguientes. Los números indican los diámetros de los halos de inhibición medidos en milímetros. Cuando los microorganismos son resistentes a los antibióticos no se detectarán halos de inhibición alrededor.

Con respecto a las cepas control, E. coli solo es sensible a rifampicina; por el contrario, S. epidermidis, es sensible a los cinco antibióticos ensayados. Los halos de inhibición aumentan según la cantidad de antibiótico dispuesto en los discos de papel de filtro.

En el caso de nuestros aislados se observan diferencias en cuanto a la resistencia a la rifampicina según la cantidad probada de este antibiótico.

Es ahora momento de sacar conclusiones. Es evidente que hemos conseguido seleccionar bacterias de nuestros cuerpos con mayor número de resistencias que los controles procedentes de la CECT. Dos de nuestras cepas, son al menos resistentes a tres antibióticos, ampicilina, cloranfenicol y rifampicina. 

En algunos casos no hay coincidencia entre las resistencias por las que habíamos seleccionado inicialmente las eepas y las que ahora hemos observado.

Es interesante ver el comportamiento similar de estas dos cepas, B2 ACR y B2 ACE 1, en cuanto a las resistencias que ahora presentan e incluso en los diámetros de los halos de inhibición. ¿Podríamos habernos equivocado al rotular y haber utilizado la misma cepa en dos antibiogramas diferentes?

En cualquier caso, uno de los objetivos de este proyecto está cumplido. Hemos seleccionado bacterias multirresistentes a antibióticos de nuestra piel o de la cavidad bucal.

Seleccionamos bacterias multirresistentes a antibióticos

Como resultado de nuestro experimento anterior seleccionamos bacterias resistentes a dos antibióticos a partir de las muestras de boca y de piel. Utilizando un procedimiento similar vamos a intentar seleccionar alguna bacteria resistente a tres antibióticos.

Para ello hemos inoculado tubos con medio de cultivo con bacterias resistentes a dos antibióticos seleccionadas de tres muestras en las que, por los resultados anteriores, era probable encontrar bacterias multirresistentes.  De nuevos las hemos sometido a la acción de los distintos antibióticos. Los resultados se muestran en la tabla siguiente.

En esta tabla, como en experimentos anteriores, se indican con signos positivos (+) la presencia de crecimiento, y por tanto la resistencia a los antibióticos. Las cruces señaladas en color rojo indican los antibióticos a los que eran resistentes las cepas de partida. Como se puede comprobar en todos los casos, se confirma esa resistencia. Las cruces en negro indican nuevas resistencias. Por el contrario, los signos negativos indican la ausencia de crecimiento de microorganismos, y por tanto, de sensibilibidad hacia los antibióticos.

Los resultados anteriores indican que, a priori, en los cultivos ensayados debe haber microorganismos resistentes al menos a tres antibióticos.

Conmemoramos el Día Internacional de la Mujer y la Niña en la Ciencia

 

Este viernes, 7 de febrero, hemos conmemorado el Día Internacional de la Mujer y la Niña en la Ciencia.  Para ello hemos organizado un coloquio titulado Las Mujeres, las Niñas y la Ciencia en el IES Zaidín Vergeles. Han participado Mayra Carolina Osorio (investigadora del Instituto de Astrofísica de Andalucía), Sara Esther Ramos (investigadora del Instituto de Parasitología y Medicina López Neyra), María Ángeles Yélamos (médica en el Centro de Salud Zaidín Sur), Ana Villar del Paso (enfermera en la UCI del Hospital Virgen de las Nieves), Alba García Gil (bióloga) y alumnas de segundo y tercero de ESO que han participado en los últimos años en diversos proyectos de investigación. Mayra Osorio dirigió un proyecto con las alumnas de entonces primero de ESO cuya finalidad era poner nombre a una exoestrella y a un exoplaneta a la vez que ha pertenecido a la comunidad educativa como madre de una de nuestras alumnas. Las otras cuatro  fueron en el pasado alumnas del IES Zaidín Vergeles que hoy desarrollan actividad profesional. Nos acompañaron también Antonio Arenas (diario Ideal) y Francisco Martínez Abarca (EEZ-CSIC), responsable de los proyectos CAOS.

Participantes en el acto conmemorativo del Día Internacional de la Mujer y la Niña en la Ciencia. Fotografía cortesía de Antonio Arenas (IDEAL).

Las ponentes hablaron al alumnado sobre su trayectoria, recordando sus vivencias cuando eran niñas, estudiantes y ahora en su vida adulta. Repasaron su experiencia investigadora desarrollada en el instituto en proyectos como PIIISA, Ciencia BaSe o CAOS a través de imágenes de entonces. Por otra parte, nuestras alumnas más jóvenes hicieron referencia a sus proyectos desarrollados en el instituto, como el mencionado sobre exoplanetas dirigidos por Mayra Osorio o el relacionado con las plantas mediterráneas y los microorganismos que las habitan, dirigido por María Ángeles Muñoz Vargas, que aunque no pudo asistir al acto envió un vídeo dirigido a las alumnas de su proyecto.

El acto se puede ver en el canal de Youtube de Ideal en Clase, la web educativa del diario Ideal. Nuestro agradecimiento a Antonio Arenas por hacerlo posible.

 

El acto fue emotivo y seguido por gran atención por el alumnado, el cual participó activamente en el turno de preguntas con el que acabó el acto.

Los resultados de nuestro segundo experimento

 Ya tenemos los resultados de los experimentos del viernes. En las imágenes que siguen a continuación podéis ver en qué tubos y con qué antibióticos se ha producido crecimiento de las bacterias. El orden de los tubos en el que están colocados los antibióticos es de izquierda a derecha: 1. Ampicilina. 2. Estreptomicina. 3. Kanamicina. 4. Rifampicina. 5. Cloranfenicol. La letra P tras el número indica que hemos seleccionado bacterias de la piel mientras que la letra B indica que lo es de la boca.

Muestra 17P - resistente a cloramfenicol

Muestra 24P - resistente a estreptomicina

Muestra 24P - resistente a ampicilina

Muestra 18P - resistente a ampicilina

Muestra 18P - resistente a rifampicina

Muestra 6B - resistente a ampicilina

Muestra 5B - resistente a estreptomicina

 La primera pregunta a la que debemos responder es si se confirman las resistencias de las bacterias que hemos seleccionado. Para ello debemos ver crecimiento positivo en el tubo con el mismo antibiótico que aquél en las que las seleccionamos. ¿Es así?

El siguiente paso es elaborar una tabla donde indiquemos las resistencias a los distintos antibióticos para cada muestra de las que tenemos en las fotografías. Podéis utilizar la que viene abajo en blanco. En el caso de que se observe crecimiento en los tubos pondremos un signo +, en el caso de que el medio se vea transparente (no ha indicios de que haya crecido nada) pondremos un signo -; si estamos dudosos, pondremos +/-.

Los resultados obtenidos a partir del análisis de los tubos se muestran en la siguiente tabla

 

 

También en la pasada sesión aprendimos a hacer siembras de bacterias en placas. Recordad que utilizamos dos medios distintos: TSA y Agar manitol. Este último medio es muy interesante, pues tiene un indicador de pH que hace que determinadas bacterias, al producir ácidos, hagan que cambie su color, volviéndolo amarillo. Como decíamos en la entrada anterior, un grupo de bacterias que hace esto son los estafilococos (Staphylococcus sp.) algunos de los cuales habitan en nuestra piel. Comenzamos a tener resultados, y ejemplo de ellos son las imágenes de las placas que os adjunto; dejaremos crecer algún tiempo más los microorganismos.

 

Esta última imagen es realmente interesante. Muestra microorganismos aislados de la piel de la misma persona. Las de arriba las sembramos a partir de tubos en los que habían crecido bacterias resistentes a la estreptomicina; por el contrario, en las de abajo se sembraron microorganismos que crecieron en el tubo al que le habíamos añadido ampicilina. Viendo el comportamiento de las placas de la derecha podemos proponer que hemos aislado distintos microorganismos con distintos requerimientos metabólicos. En estos días seguiremos viendo resultados. Mientras tanto ¿qué opináis de todos estos resultados?

¿Habrá en nuestras muestras bacterias resistentes a más de un antibiótico?

 En la última sesión del proyecto nos hemos planteado aislar bacterias que sean resistentes a más de un antibiótico. Para ello hemos partido de una selección de tubos con medios con diversos antibióticos en los que habíamos obtenido crecimiento de microorganismos. El procedimiento ha sido el mismo que en el experimento anterior: hemos inoculado 20 microlitros de esos cultivos en 5 ml de medio de cultivo adicionados con 5 microlitros de los distintos antibióticos. 

Someter las bacterias al mismo antibiótico que añadimos en el tubo del cual hemos tomado la muestra nos permitirá confirmar que, efectivamente, esas bacterias son resistentes a ese fármaco. Si el crecimiento fuese ahora negativo en ese tubo indicaría que en el proceso habríamos cometido algún error, por ejemplo no haber puesto antibiótico el primer experimento.

También en esta sesión hemos aprendido a sembrar bacterias en medios sólidos. Para ello utilizamos placas de Petri estériles en las que hemos dispuesto medios de cultivo. Estos son, al igual que los usados en los cultivos líquidos, soluciones nutritivas en las que pueden crecer las bacterias, pero que en este caso llevan agar; se trata de una sustancia gelificante que va a espesar el medio dándole una consistencia semisólida. Hemos utilizado placas con dos medios de cultivo. Uno de ellos es TSA (Agar de Soja y Tripticaseína) y Agar manitol. El primero tiene la misma composición que el utilizado en los experimentos con medios líquidos más el agar. El segundo es un medio especifico, es decir, un medio con capacidad para seleccionar determinados microorganismos. Es un medio con alta concentración de sales que lleva incorporado un indicador de pH, por ello tiene un llamativo color rojizo. Este medio es selectivo para los estafilococos (Staphylococcus sp) bacterias comunes de la piel.

 Para sembrar microorganismos en cultivos sólidos necesitamos un asa de siembra (en la imagen) que esterilizaremos poniéndola al rojo a la llama de un mechero bunsen cada vez que tomemos muestra de nuestras bacterias.

Asegurándonos que se ha enfriado introduciremos en el medio con el cultivo y tomaremos la muestra.

Tomaremos la placa de Petri con el medio de cultivo y procederemos a sembrar en estría. Para ello deslizaremos suavemente el asa sobre la mitad de la placa dibujando líneas; giraremos esta 90 grados y repetiremos el procedimiento sin tomar muestra, es decir, extendiendo lo que hayamos puesto en la placa, e igualmente una tercera vez. Al final toda la placa estará inoculada y cabrá esperar que cada vez hayamos puesto menos bacterias por lo que será probable que obtengamos colonias independientes que podríamos aislar.

En cualquier caso, y cómo se ve en las imágenes de arriba, aprendisteis bastante bien la técnica. Pero no estaría mal que contaseis vuestra experiencia en los comentarios.