Este curso dedicamos nuestros proyectos a la búsqueda de antimicrobianos. En las páginas de este blog se pueden ver nuestros avances en la detección de posibles efectos inhibidores del crecimiento de extractos vegetales y de aceites esenciales de procedencia vegetal. Pero además de las plantas, tanto los hongos como otros microorganismos son capaces de producir este tipo de sustancias.
Las bacterias también producen antibióticos. La estreptomicina o la bacitracina son ejemplos de sustancias de un amplio espectro que resultan activas frente a microorganismos de otras especies. En otras ocasiones el efecto se ejerce únicamente sobre cepas de la misma especie o especies muy próximas; en este caso hablamos de bacteriocinas. Igualmente pueden producir otros tipos de compuestos, como ácidos o agua oxigenada, que también pueden llegar a inhibir el crecimiento de otras bacterias.
Como complemento al proyecto de antimicrobianos vegetales nos hemos planteado identificar algunas bacterias productoras de sustancias inhibidoras del crecimiento. Nuestro punto de partida han sido muestras de suelo procedentes del huerto de nuestro instituto junto a otras proporcionadas por nuestro alumnado de segundo de bachillerato tomadas en distintas localidades como Cenes, Melegís, Restábal o Churriana de la Vega. Otras muestras han sido tomadas de hojas de diversos árboles.
Suspendimos el suelo en suero fisiológico estéril y diseminamos en placa para obtener colonias aisladas. Las hojas, bien se colocaron directamente sobre el agar de las placas de Petri o se suspendieron en suero fisiológico y se extendieron sobre las mismas. Una vez crecidas, se tomaron muestras de las colonias aisladas y se llevaron a nuevas placas, identificándose con un código que recordase su procedencia. Para todos nuestros experimentos hemos utilizado el medio de cultivo TSA (agar de soja y tripticaseína). Algunas de las placas originales se pueden ver en la imagen de arriba.
Con las bacterias aisladas se inocularon nuevos cultivos en placa, de modo que las colonias creciesen regularmente repartidas en éstas. Se incubaron y se ensayó la actividad antibacteriana frente a la bacteria gram positiva Bacillus megaterium y la gram negativa Escherichia coli.
Para ello se inocularon tubos que contenían 5 ml de agar semisólido (medio TSB + agar al 0,6%) a una temperatura en torno a los 42-45 ºC con 100 microlitros de cultivos de ambos microorganismos. Inmediatamente se vertía el contenido de los mismos asegurándose de que cubría por completo a todas las colonias. El objetivo era el crecimiento en césped de las bacterias de prueba sobre el agar de la placa. Los cultivos se incubaban en la estufa a 28ºC.
La presencia de actividad antimicrobiana se detecta por la aparición de halos de inhibición alrededor de las colonias, es decir, de zonas en las que las bacterias de prueba o no crecen o lo hacen con dificultad.
Las imágenes muestran las primeras placas con nuestros resultados. Las dos primeras las hemos obtenido en nuestro laboratorio; la tercera corresponde a aislados que ha hecho Manuel Espinosa en la Estación Experimental del Zaidín a partir de unas placas que se nos contaminaron. En cualquier caso comprenden casi la totalidad de nuestros aislados. En estas placas se puede apreciar cómo algunos microorganismos inhiben el crecimiento de las bacterias de prueba. ¿En cuáles se aprecia actividad antimicrobiana?
Nuestro propósito ahora es identificar y conocer cómo son algunos de estos microorganismos. Esta fase del proyecto la llevaremos a cabo en la Estación Experimental del Zaidín y para ello utilizaremos técnicas de análisis de ADN. Pero antes de ello debemos elegir a nuestros mejores candidatos, que deben ser quienes más actividad muestren frente a las bacterias de prueba.
Y ahora es momento de plantear algunas preguntas. ¿Cómo podemos dar una medida de la actividad antibacteriana que nos permita comparar a nuestros microorganismos? ¿Qué criterios deben cumplir las cepas que seleccionemos? ¿Cómo debemos trabajar? ¿Qué microorganismo o microorganismos proponéis para nuestros estudios posteriores? ¿Qué sugerencias proponéis para completar nuestro proyecto? Compartamos nuestras respuestas en los comentarios.
Buenas tardes, en mi opinión y respondiendo a la primera pregunta efectuada; creo que si nos fijamos bien, en todas las placas hay indices de actividad antimicrobiana. En la primera foto, como bien se puede apreciar, en la bacteria LA1, hay un halo de inhibición totalmente transparente, es decir, zona en la que la bacteria no crece o lo hace con dificultad. Y se puede apreciar, que de la misma manera ocurre en la bacteria CH3. En la segunda placa también ocurre en la bacteria CH3, aunque esta placa tendría más posibilidades de ser descartada por mi parte ya que no se puede observar con la misma exactitud que en la primera.
ResponderEliminarEn la tercera y cuarta placas, se aprecia un poco de contaminación por lo que no se distingue con mucha claridad, pero aún así, podemos ver una marcada inhibición en la bacteria S4 en la tercera placa, y en la cuarta, alrededor de la SA3 otra; de la misma manera que existe una posible inhibición entre las bacterias PH1 y LA1. Por último en la quinta y última placa, se distinguen tres claros halos en las bacterias LA1, LA2 y CH3.
Con respecto a la segunda pregunta, un buen método para comparara nuestros microorganismos sería someterlos a distintas variaciones de temperatura, presión, humedad en el aire... y ver el comportamiento obtenido por cada una de ellas y descubrir poco a poco las diferentes características presentadas.
A la siguiente pregunta , los criterios necesarios para nuestras cepas son, en primer lugar, que los microorganismos estén y lleguen vivos. También creo que sería de mucha importancia saber con certeza que no son tóxicos para su posible manipulación y propia seguridad nuestra. Resaltar también, que es conveniente que estén lo menos contaminados posible ya que podría afectarnos a la hora de examinarlas. Y por último y uno de los más importantes, es muy necesario que tenga una correcta etiquetación y nomenclatura especifica.
Debemos trabajar con constancia y precaución, ya que al ser un proyecto de laboratorio puede ser tanto muy beneficioso como peligroso. Es importante que trabajemos con orden y siendo precavidos en todo momento. Debemos de ir informados pero sobretodo,tenemos que ir con ganas de aprender y de disfrutar esta posible gran experiencia que se nos plantea, porque creo que esa es la mejor manera de que las cosas salgan bien; con trabajo, esfuerzo, constancia y ganas.
Para nuestros estudios posteriores, yo propongo microorganismos acuáticos, es decir, una vez visto este proyecto, podríamos hacerlo de la misma manera pero esta vez con organismos acuáticos: Algas marinas, de la misma manera que cogimos organismos autótrofos terrestres como por ejemplo hojas de un olivo, esta vez coger algas marinas. También, obtener suelo de zonas húmedas con influencia de ríos, lagos o mares y ver como se comportarían las bacterias y sus antimicrobianos en las diferentes placas.
Respondiendo a la última pregunta y finalizando la anterior, podríamos completar nuestro proyecto comparando los comportamientos, resultados y características de las placas tanto terrestres como marinas y de ahí, ver resultados y diferencias antimicrobianas. Sería una gran oportunidad para ver también la gran variabilidad genética que puede haber de unas especies de bacterias a otras.
Buen comentario Alejandra. Para tu tranquilidad te diré que las cepas con las que probamos son bacterias que no son patógenas; se eligen precisamente no patógenas para que no tengamos problemas. Y las que hemos aíslado a partir de vuestras muestras provienen de hojas de plantas o del suelo, no de organismos patógenas.
EliminarBuenas soy Santiago Díaz de 2º de Bachillerato ^.^,
ResponderEliminarEl criterio a la hora de comparar la efectividad de las muestras ha de ser este halo alrededor de la muestra que nos indica el carácter antimicrobiano ante el el/los microbio(s) del ensayo, comparando así su capacidad inhibidora en cuestión de dicho halo. Distinguida también una fuente de la cepa en cuestión y confirmada la efectividad de esta, resultaría interesante la búsqueda de una cepa con una mayor especificidad (lo que le brindaría una mayor funcionalidad sin unos daños colaterales indeseados).
Surge de esto último mi sugerencia, y es que quizá sería atractivo el estudio de algunos antimicrobianos (no solo de origen bacteriano) y su efecto en algunas de las bacterias más importantes de la flora intestinal o su posible daño en estructuras vegetales, hallando así funciones farmacéuticas y agrícolas.
Buen comentario, Alejandra. Efectivamente propones algunos de los microorganismos que producen alguna sustancia que inhibe el crecimiento.
ResponderEliminarCon respecto a la seguridad, te comento. Las bacterias que hemos aislado y que crecen en las placas de las imágenes no deben ser patógenas puesto que las hemos aislado del suelo o de hojas de plantas. Tu misma te las pudiste llevar en las manos si hubieses cogido la tierra del suelo o la hoja de cualquier planta. No son bacterias que aislemos de animales con enfermedades infecciosas, así que no hay riesgo. Para tu tranquilidad te digo también, que la proporción de bacterias patógenas es inferior al 1% de las conocidas. Lo mismo te digo de las bacterias frente a las que probamos la actividad; se trata de cepas inocuas que no causan problemas. Pero además, trabajáis en condiciones de asepsia, nunca tocáis las bacterias; utilizáis para ello material esterilizado.
Y está bien tu propuesta de aislar bacterias acuáticas; probablemente sean más difíciles de cultivas. Vamos a ver qué conseguimos con las nuestras y ya nos plantearemos otras cosas. De todas formas, muy bien y te animo a que sigas participando en nuestros proyectos y colabores con tus comentarios.
Buenas tardes, en respuesta a la primera pregunta: en lo que debemos fijarnos a la hora de ver si una bacteria puede tener propiedades antimicrobianas, es el halo de inhibición que se forma alrededor de ellas, indicándonos que en cierto momento del desarrollo, dejan de crecer lo que podría indicar indicios de que sean bacterias con propiedades antibióticas puesto que frenan su crecimiento. Podemos comprobar este halo en la placa de Santi (LA1) y en la mia (CH3).
ResponderEliminarDebemos trabajr en condiciones de esterilidad, porque sino nuestros medios de cultivo podrian contaminarse, como pasó con dos de las placas, que las tuvimos mucho tiempo descubiertas y muy cerca de la boca transmitiéndole las bacterias del aire o de nuestra boca respectivamente.
Los próximos microorganismos con los que podríamos trabajar podrían ser los que albergan plantas como el aloe vera, el ajo, el eucalipto, que en mi familia siempre he escuchado que se usaban antiguamente como antibióticos pero estaría bien saber si realmente tiene una base científica.
Una buena forma de concluir este proyecto sería haciendo divulgación y compartiendo nuestros resultados, que podrían ser aplicables a la vida cotidiana, con más personas además de Manolo (nuestro supervisor en la sombra), el profe y los compañeros que lo estamos llevando a cabo.
Marta Casas 2ºBach
Buenas tardes, en respuesta a la primera pregunta podemos saber y comparar cual es la bacteria más efectiva gracias a la presencia de halos de inhibición, la bacteria con mayor halo es la más efectiva en este caso serían las bacterias CH3 o LA2, las cuales tienen grandes halos, para saber cual es más efectiva a la larga tendríamos que seguir estudiándolas. las cepas que seleccionemos deben tener propiedades antimicrobianos para poder ver así mejores resultados.
ResponderEliminarRespecto a la tercera pregunta deberíamos encontrar en un entorno esterilizado para evitar la contaminación de las placas, es decir utilizar material esterilizado, no dejarlas abiertas por mucho tiempo, tener cuidado de no hablar/toser cerca de la placa abierta, asegurarnos de que el preparado esta hecho correctamente, etc.
Para estudios posteriores seria curioso ver la respuesta de plantas como el cactus o el jazminero ademas de flores como la rosa o el tulipán.
Podemos concluir este proyecto con la realización de un post que recopile toda la información que hemos recogido.
Buenas tardes, en respuesta a las preguntas propuestas; de las seis placas que tenemos en las imágenes, podemos observar la actividad antimicrobiana de las dos primeras en LA1 y CH3, en las dos siguientes se encuentra en SM5, SA3 y 01 entre otras, y en las últimas en LA1, LA2 y de nuevo en CH3.
ResponderEliminarEn respuesta a la segunda pregunta, una medida de la actividad antimicrobiana que nos permita comparar nuestros microorganismos puede ser modificar su temperatura.
Respecto a la tercera pregunta, es necesario que las cepas que seleccionemos tengan halos de inhibición y estén en buenas condiciones para poder trabajar con ellas.
Por último, y en respuesta a las preguntas restantes, debemos trabajar con cuidado ya que es un material bastante delicado y no podemos descuidarnos. Podríamos realizar estudios posteriores con hongos. El proyecto podría completarse sembrando distintas bacterias en agares específicos, para por ejemplo, sacar las esporas que son las formas resistentes de las bacterias.
María Medina 2º BACH
Hola buenas tardes, ante todo darte las gracias por querer elaborar este experimento con nosotros, dejarnos ser partícipes de ello y darnos la oportunidad de poder ir a la Estación Experimental del Zaidin.
ResponderEliminarCon respecto a la primera pregunta; gracias a los halos de inhibición alrededor de las colonias podemos saber cuales son las que mayor actividad tienen, en las primeras dos placas podemos observar una mayor actividad en LA1, CH3, S4,SZV7 y MR2 (aunque en menor cantidad estas dos últimas). En las dos placas siguientes podemos observar halos de inhibición en S3, S4, SM2, SM6, SM5, LA1 y PH1, como podemos observar algunas son de mayor tamaño a otras. Y en la tercera y última imagen que corresponde a los aislados que ha hecho Manuel Espinosa en la Estación Experimental del Zaidín a partir de las placas que se nos contaminaron, podemos observar halos de inhibición en LA1 y CH3.
En respuesta a la segunda pregunta, existen multitud de parámetros que nos permiten diferenciar la actividad antibacteriana entre distintos organismos como es la consistencia del medio, la presencia de oxígeno u otros gases, la humedad, la temperatura e incluso la luz ambiental. Modificar cualquiera de estos nos permitiría obtener distintos resultados. Por otra parte, también es importante atender a los distintos tipos de compuestos que inhiban el crecimiento bacteriano para su estudio, que como se indica en este ejercicio pueden ser distintos ácidos o agua oxigenada.
Respondiendo a la pregunta tres, principalmente se debe apreciar con claridad los halos de inhibición que rodean las colonias, lo cuál significará que su crecimiento no puede progresar debido a la actividad de las bacterias sobre las muestras.
¿Cómo debemos trabajar? Siempre que trabajemos con bacterias o cualquier otro microorganismo que pueda llegar a ser patógeno para las personas, se deben tener en cuenta distintas medidas de prevención tales como utilizar equipos de protección adecuados como guantes, bata, etc. además de llevar a cabo una correcta manipulación de la muestra y utilizando el material necesario para su estudio y conservación. También si es posible debemos trabajar con material esterilizado para evitar contaminaciones y rotular adecuadamente las muestras con las que vamos a trabajar.
Para nuestros estudios posteriores sería interesante comprobar la actividad antimicrobiana sobre otro tipo de bacterias presentes en el medio o en las personas, como es el caso de bacterias que se encuentran en la propia piel. Por otra parte, el estudio de los hongos me llama bastante la atención dada la facilidad que muestran muchos de ellos para desarrollarse y formar colonias, podría ser una investigación proponer en el futuro. Además, es bastante sencillo obtener muestras de hongos en el medio que nos rodea para su estudio.
Por último, para completar nuestro proyecto sería interesante utilizar otros tipos de medio de cultivo que pueda favorecer el crecimiento de distintas muestras bacterianas y que permitieran ver la formación de sus colonias en las placas.
Muy bien, Esther. Muy buen comentario y propuestas muy interesantes. Es verdad que los medios de cultivo pueden influir sobre la producción de antimicrobianos, así como las condiciones de cultivo. Yo trabajé con una bacteria que producía agua oxígenada e inhibía el crecimiento de muchas bacterias; y la actividad está relacionada con el medio que se usaba y con pasar de cultivarla en ausencia de oxígeno a que lo hiciera en su presencia. Tendremos en cuenta tus propuestas para próximos proyectos. Gracias!!!!
ResponderEliminarBuenas tardes,mi respuesta a la primera pregunta;podemos dar una medida de inhibición bacteriana gracias a los halos de inhibición que presentan las bacterias en el medio de cultivo.En la primera imagen,si nos fijamos bien podemos apreciar como las bacterias LA1,CH3 y S4 presentas dichos halos.en la segunda imagen se aprecian en las bacterias SZV6 y MR2.En el siguiente dúo de placas podemos apreciar bacterias con actividad antimicrobiana ,estas son S3, S4, SM2, SM6, SM5, LA1 y PH1.Finalmente las dos últimas placas (que tuvieron que ser aisladas por Manuel Espinosa debido a la contaminación que apareció) las bacterias ha destacar son LA1, LA2 y CH3.
ResponderEliminarRespondiendo a la segunda pregunta, un posible método de comparación para nuestros microorganismos sería someterlos a distintas cambios tanto fisiológicos como del medio y dependiendo de los resultados obtenidos hallar conclusiones ;obviando que presentes halos de inhibición.
Para trabajar con ellas o cualquier otro microorganismo debemos usar guantes,bata, gafas protectoras,etc para evitar la manipulación física debido a los distintos patógenos que puedan contener .Asimismo todo el material del laboratorio que vayamos a usar debe estar previamente esterilizado ,tampoco debemos olvidar nombrar o marcas las placas de Petri u otros recipientes para no mezclar muestras.
Para posibles proyectos propongo la investigación en las legumbres,aguas y raíces presentes en distintos entornos.También podríamos investigar sobre las bacterias presentes en las mucosas o incluso en los objetos que más usamos .
Para concluir propongo hacer un "minidocumental" para ayudar o contribuir con un granito de arena sobre la ciencia;este vídeo también informaría a futuras generaciones y que se planteasen ir más allá.
Hola, tras leer esta información y tras buscar más detalles voy a responder a las preguntas que se han planteado en este apartado del blog. Empezaré respondiendo a la primera pregunta: si nos fijamos en los halos de inhibición y en la medida de su radio podemos llegar a la conclusión de que en la primera foto destaca por ejemplo,S4; en la segunda, S3, S4 Y PH1 y en las placas las cuáles trabajó Manuel Espinosa se diferencia CH3. En cuanto la segunda pregunta, como he mencionado antes para dar una medida de la actividad antibacteriana podemos medir el radio del halo de inhibición, además podemos realizar un antibiograma( un conjunto de pruebas que nos permiten medir la sensibilidad). Para la tercera pregunta, creo que las bacterias que seleccionemos deben de estar controladas para que estén a óptimas temperaturas y podamos tener un seguimiento de estas. Además pienso que siempre debemos trabajar con utensilios esterilizados para no producir ninguna alteración siendo esta mi respuesta a la cuarta pregunta.Para estudios posteriores podríamos investigar bacterias intracelulares las cuáles pueden sobrevivir incluso a los propios mecanismos de defensa del cuerpo. Por último para completar nuestro proyecto, sería útil que se difundiera para que más instituciones vieran los hallazgos que hemos descubierto y contribuyeran si investigan algo relacionado con esto.
ResponderEliminarBuen comentario, Marina. Bueno, sí que las instituciones están al cargo. Todo esto lo podemos hacer gracias a la Estación Experimental del Zaidín, centro del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, y personalmente a Manuel Espinosa, quien nos dirige y asesora en nuestros proyectos. Quien sabe, lo mismo encontramos algo que pueda dar lugar a mucho más. Sin ir más lejos, a partir de un proyecto desarrollado con alumnos dentro del PIIISA, los propios estudiantes plantearon un estudio sobre los efectos antioxidantes de la granada que sirvió de punto de partida para una investigación posterior que hace poco se publicó.
EliminarLo importante es que vosotros seáis conscientes de que trabajamos, quizá con menos medios, pero con las mismas técnicas básicas con las que se llevan a cabo las investigaciones reales. Y aunque no descubriéramos nada llamativo, lo importante es que vosotros estáis descubriendo la investigación y participando en proyectos reales.
La medida de actividad antibacteriana podemos basarnos en la medida del
ResponderEliminarhalo de inhibición. Cuanto mayor sea el halo de inhibición mayor será la
actividad antibacteriana.
En nuestros experimentos es complicado llegar a conclusiones claras, parece
que el medio con el inóculo de e. coli y con Bacillus megaterium no estaban
bien preparados. Podemos pensar a partir de la placa de Santi que la cepa
CH3 y LA1 tienen poder antimicrobiano frente a e. coli. Aunque parecen que
está muy crecidas. En la placa de Marta solo CH3 parece que tiene poder
antimicrobiano. Las placas de Bacillus megaterium están muy crecidas
aunque parece que SM5 y Sm2 tienen halo y que además se han unido. S4
también tiene algo de halo aunque parece que hay contaminación en esta
placa.En la otra placa es complicado llegar a una conclusión pero parece que
O1 tiene un halo que indicaría poder antimicrobiano. EN la placa de Manolo
Espinosa se confirma que CH3 y LA1 tienen poder antimicrobiano pero la que
presenta mayor halo de inhibición es LA2. Aquí O1 parece que no tiene
poder bactericida.
¿Qué criterios deben cumplir las cepas que seleccionemos?
Deben de ser capaces de crecer en nuestro medio y condiciones.
¿Cómo debemos trabajar?
Siempre debemos extremar las condiciones de esterilidad para evitar
contaminaciones cruzadas con otro tipo de bacterias. Tanto el material de
trabajo, como el material de cultivo deben autoclavarse (alta temperatura y
presión). Los experimentos que realicemos deben ser por triplicado mínimo
para poder llegar a conclusiones reales. Las condiciones de cultivo deben ser
apropiadas para todas las cepas, tanto el medio como la temperatura.
Debemos ser muy cuidadosos a la hora de poner las gotas de
bacterias/sustancias a estudiar su actividad antimicriobiana de manera que
no se mezclen.
¿Qué microorganismo o microorganismos proponéis para nuestros estudios
posteriores?
Seleccionaría microorganismos presentes en alimentos o sustancias naturales en
alimentos que consumimos habitualmente frente a bacterias que pueden convertirse
en patógenas para nosotros como e.coli.