¿Aceites esenciales de plantas como agentes antimicrobianos?

Cuando iniciábamos este proyectos nos planteábamos varios objetivos, uno de ellos era demostrar que el problema de la existencia de bacterias multirresistentes a antibióticos no es algo que nos pille de lejos, sino que en nuestro propio organismos podíamos encontrarlas. En nuestro diseño experimental hemos llevado a cabo una selección artificial a partir de muestras que nos hemos tomado, principalmente de la piel y de la boca, para cinco antibióticos. Hemos hecho ensayos hasta aislar bacterias resistentes a tres de ellos. ¿Qué hubiese pasado si hubiésemos ensayado un mayor número de antibióticos?

Dado que el problema de las superbacterias es que no hay antibióticos que les hagan frente, se hace necesario la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos. Dada nuestra experiencia en proyectos anteriores decidimos hacer ensayos con aceites esenciales.

El procedimiento ha sido el mismo que para los antibióticos. Hemos preparado placas de Petri con 20 ml de medio TSA sobre el que hemos añadido 5 ml de agar semisólido inoculado con las bacterias aisladas. Una vez solidificado el medio hemos dispuesto discos de papel Whatman sobre los que hemos depositado 5 µL de los aceites esenciales que se detallarán después. Los resultados se muestran en la tabla siguiente, en la que las dimensiones de los diámetros de los halos de inhibición vienen representados en milímetros.

 Los aceites esenciales ensayados son:

AT: árbol del te. ES: espliego. HI: hisopo. MJ: mejorana. GE: geranio. AJ: ajedrea. MN: menta. PA: palmarosa. BE: bergamota. LA: lavandín. TO: tomillo. RO: romero. RA: ravintsara. EN: enebro. SA: salvia.

En un primer análisis se puede observar cómo las cepas bacteriana de control son, en general, sensibles a la mayoría de los aceites esenciales ensayados.  En el caso de nuestras bacterias multirresistentes, se observa una mayor resistencia también a los aceites esenciales.

Los aceites esenciales no tienen todos la misma capacidad antimicrobiana. Destacan los de ajedrea y tomillo, activos frente a todas las cepas ensayadas. Los menos efectivos han resultado ser los de hisopo, bergamota y romero. 

Realizando antibiogramas

Como resultado del experimento anterior hemos obtenido tubos con cultivos en medio líquido en los que hay bacterias resistentes al menos a tres antibióticos. Aunque en algún caso hemos observado crecimiento en todos los tubos, no podemos estar seguros de que hay bacterias que sean resistentes a los cinco antibióticos ensayados simultáneamente, sino al menos a tres de ellos, los dos de partida y el añadido al tubo. Esto se justifica porque cuando aislamos bacterias, bien de la piel o de la boca, pueden ser de distintas especies y, dentro de estas, con distintas resistencias.

A partir de estos crecimientos en medio líquido hemos tomado muestras que hemos extendido en placas de Petri con la dilución apropiada para obtener colonias separadas. A partir de ahí hemos aislado algunas para someterlas a un antibiograma, un estudio en el que se verá, en medio sólido, la resistencia de una determinada cepa bacteriana a los distintos antibióticos ensayados. 

Para llevar a cabo un amtibiograma preparamos placas con 20 ml de medio de cultivo TSA. Sobre este se van a verter cinco mililitros del agar blando (TSB + agar 0,6%), inoculado con 100 µL de cultivo en medio líquido de la bacteria de prueba. Como control hemos ensayado dos cepas de la Colección Española de Cultivos Tipos, una de Escherichia coli (Gram negativa) y otra de Staphylococcus epidermidis (Gram positiva); cuya referencia se indican en las tablas. Una vez solidificado se han dispuesto sobre la superficie del medio discos de papel Whatman regularmente espaciados impregnados de los antibióticos a ensayar. Se han realizado dos ensayos, en ambos casos con los antibióticos que nos dio Manuel Espinosa (ver entrada anterior) a una dilución 1:200, de modo que la dilución en el medio de las placas fuese la misma que en el medio de cultivo líquidos de los primeros ensayos. En el primero se añadieron 5 µL de antibiótico mientras que en el segundo se dispusieron 10 µL.

En la denominación de nuestras cepas es importante señalar que los grupos de tres letras finales corresponden a las iniciales de los antibióticos a los que inicialmente presentaban resistencia. Por ejemplo, la cepa P2 ACK se aisló siendo seleccionada por su resistencia a Ampicilina, Cloramfenicol y Kanamicina. 

Los resultados se expresan en las tablas siguientes. Los números indican los diámetros de los halos de inhibición medidos en milímetros. Cuando los microorganismos son resistentes a los antibióticos no se detectarán halos de inhibición alrededor.

Con respecto a las cepas control, E. coli solo es sensible a rifampicina; por el contrario, S. epidermidis, es sensible a los cinco antibióticos ensayados. Los halos de inhibición aumentan según la cantidad de antibiótico dispuesto en los discos de papel de filtro.

En el caso de nuestros aislados se observan diferencias en cuanto a la resistencia a la rifampicina según la cantidad probada de este antibiótico.

Es ahora momento de sacar conclusiones. Es evidente que hemos conseguido seleccionar bacterias de nuestros cuerpos con mayor número de resistencias que los controles procedentes de la CECT. Dos de nuestras cepas, son al menos resistentes a tres antibióticos, ampicilina, cloranfenicol y rifampicina. 

En algunos casos no hay coincidencia entre las resistencias por las que habíamos seleccionado inicialmente las eepas y las que ahora hemos observado.

Es interesante ver el comportamiento similar de estas dos cepas, B2 ACR y B2 ACE 1, en cuanto a las resistencias que ahora presentan e incluso en los diámetros de los halos de inhibición. ¿Podríamos habernos equivocado al rotular y haber utilizado la misma cepa en dos antibiogramas diferentes?

En cualquier caso, uno de los objetivos de este proyecto está cumplido. Hemos seleccionado bacterias multirresistentes a antibióticos de nuestra piel o de la cavidad bucal.

Seleccionamos bacterias multirresistentes a antibióticos

Como resultado de nuestro experimento anterior seleccionamos bacterias resistentes a dos antibióticos a partir de las muestras de boca y de piel. Utilizando un procedimiento similar vamos a intentar seleccionar alguna bacteria resistente a tres antibióticos.

Para ello hemos inoculado tubos con medio de cultivo con bacterias resistentes a dos antibióticos seleccionadas de tres muestras en las que, por los resultados anteriores, era probable encontrar bacterias multirresistentes.  De nuevos las hemos sometido a la acción de los distintos antibióticos. Los resultados se muestran en la tabla siguiente.

En esta tabla, como en experimentos anteriores, se indican con signos positivos (+) la presencia de crecimiento, y por tanto la resistencia a los antibióticos. Las cruces señaladas en color rojo indican los antibióticos a los que eran resistentes las cepas de partida. Como se puede comprobar en todos los casos, se confirma esa resistencia. Las cruces en negro indican nuevas resistencias. Por el contrario, los signos negativos indican la ausencia de crecimiento de microorganismos, y por tanto, de sensibilibidad hacia los antibióticos.

Los resultados anteriores indican que, a priori, en los cultivos ensayados debe haber microorganismos resistentes al menos a tres antibióticos.