Estudiamos el carácter antimicrobiano de los extractos de granada en medio líquido

En la entrada anterior pudimos valorar el efecto de los distintos disolvente sobre la extracción de las sustancias con carácter antimicrobiano de la granada en medio sólido. Hemos llevado a cabo nuevos experimentos, en este caso para valorar el efecto de dichos extractos sobre el crecimiento de los microorganismos en medio líquido.

Para ello preparamos tubos de ensayo con 5 ml de medio TSB (caldo de triptona y soja) estériles y los inoculamos con 20 microlitros de cultivos líquidos de las bacterias de prueba: E. coli, B. subtilis, Dickeya, Ralstonia y Xanthomonas. Un lote no se trató con extractos para ser usado como control. Al resto se les añadió 50 microlitros de los extractos a ensayar. Se eligieron, en función de su capacidad de inhibición, los de etanol al 70% y los de acetona al 70%. Se incubaron durante 20 horas a 28ºC y se valoró la turbidez de los cultivos con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Los resultados se muestran en las siguientes tablas. En unas se muestran los resultados de absorbancia de cada cultivo. A efectos comparativos entre todos los distintos tratamientos, los valores de absorbancia se han referido al crecimiento máximo en los cultivos sin tratar; en estos se ha considerado 1. Los resultados se muestran en las tablas siguientes:

Los resultados de los experimentos en medio líquido confiman el carácter inhibidor de los extractos de granada. Los resultados son similares con ambos disolventes, ligeramente superiores cuando se ha usado la acetona al 70% para la extracción. En Xanthomonas, que ha crecido muy poco, los resultados parecen más llamativos, con una mayor capacidad de inhibición.

Es momento de interpretar estos resultados y proponer nuevos experimentos.

Retomamos nuestros experimentos sobre antimicrobianos vegetales

A lo largo del curso pasado llevamos a cabo dos interesantísimos proyectos sobre antimicrobianos vegetales. En uno de ellos obteníamos extractos de una serie de plantas y ensayábamos su capacidad de inhibir el crecimiento de las bacterias en medio sólido. Y también estudiamos esta propiedad en los aceites esenciales. Si repasamos entradas anteriores veremos que las hojas de rosal, las de eucalipto o la corteza de granada presentaban una actividad significativa. Nuestros proyectos se interrumpieron como consecuencia de la pandemia causada por el coronavirus, y aunque pudimos llevarlos a término dejamos algunas espectativas pendientes.

Hemos retomado el estudio de las propiedades antimicrobianas de los extractos de granada. Nos hemos planteado en primer lugar estudiar la eficacia de distintos disolventes para la extracción de las sustancias antimicrobianas.  Para ello hemos desecado la corteza de granada en la estufa a 45ºC durante una semana y la hemos reducido a polvo con la ayuda de un mortero, tamizando el producto para evitar fragmentos grandes y facilitar el proceso de extracción.

Los solventes empleados han sido etanol al 70%, etanol al 100%, metanol al 70%, metanol al 100%, acetona al 70%, acetona al 100% y agua destilada. Los extractos se han preparado añadiendo 10 ml de disolvente a 2 gramos de extracto de granada, dejándose macerar durante una semana. Pasado este tiempo se ha separado el extracto de los restos de corteza de granada y se ha conservado en el congelador.

Seguidamente se procedió a ensayar la actividad de estos extractos mediante la técnica de difusión en disco. Para ello se han preparado placas de Petri con medio TSA sobre el que se han vertido 5 ml de agar semisólido (medio TSB + agar al 0,6%) inoculados con las bacterias de prueba. Sobre una rejilla de plástico desinfectada con etanol se han dispuesto discos de papel Whatman a los que se ha añadido 20 microlitros de extracto en dos dosis de 10 microlitros, la segunda una vez seca la primera. Las placas se han incubado a 28ºC. Se prepararon placas de control con las mismas bacterias con discos impregnados con la misma cantidad de disolventes. Los ensayos con las bacterias se han hecho por triplicado. Los microorganismos ensayados han sido Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas putida, Dickeya, Ralstonia y Xanthomonas.  La imagen siguiente muestra los halos de inhibición en las distintas placas.

Los valores medios de medidas de los halos de inhibición de muestran en la tabla adjunta. Se expresa el diámetro de estas expresado en milímentros. El diámetro de los discos de papel Whatman es de 6 mm.

A partir de estos resultados podemos valorar qué disolventes son los más apropiados o que bacterias son más sensibles a los componentes de la corteza de la granada de entre las ensayadas. ¿Qué opináis?