Colaboramos con el proyecto ¿Sueñan los pimientos con la medicina?

Uno de los proyectos que llevamos a cabo este año en colaboración con la Estación Experimental del Zaidín va encaminado a conocer la relación entre los pimientos y la salud.  Y una de las actividades a realizar es la encuesta que aquí adjuntamos y que tiene como objetivo ver lo que la ciudadanía conoce sobre estas hortalizas, sus variedades, su aporte nutritivo o sus posibles virtudes terapéuticas. Nuestra meta obtener la mayor cantidad posible de información y para ello es necesario que pasemos la encuesta al mayor número de personas. Por eso os pedimos que difundáis la actividad y colaboréis con el mayor número posible de entrevistas.

El cuestionario es anónimo para los participantes. Sin embargo, se ha incluido en el mismo un apartado al final llamado observaciones donde se puede hacer constar quién es responsable de haber pasado la encuesta a sus conocidos. La encuesta se puede cumplimentar desde esta misma página. Añadimos también el enlace a la misma por si resulta más fácil compartirla. 

Cuántas más encuestas consigamos, más precisos serán nuestros resultados. Por favor, colaborad.

https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdr3vyODqIlcV5WPqUDX_JEUPYNg6XZx7uczifi348oh5uwAQ/viewform?usp=sf_link

El misterioso caso de la capsaicina

Uno de los proyectos que tenemos este año va dedicado a los pimientos. Se trata de estudiar las propiedades saludables que tiene esta hortaliza y para ello estudiaremos diversas variedades de pimientos: el dulce, el boiro (una variedad de pimiento de Padrón), el jalapeño verde, el chile rojo y el habanero rojo. Nuestros progresos se pueden ver en el blog ¿Sueñan los pimientos con la medicina? 

Uno de los aspectos que nos hemos planteados es valorar si las variedades de pimientos que tenemos contienen sustancias inhibidoras del crecimiento de microorganismos. Tenemos experiencia en ello después de nuestros proyectos del curso anterior con los extractos vegetales y los aceites esenciales. Y la literatura nos dice que una de estas sustancias,  la capsaicina -a la vez responsable del sabor picante de los pimientos- la tiene. Y puesto que teníamos pimientos con distinto grado de acrimonia, era de esperar que alguno de ellos tuviera esta propiedad. Utilizamos la técnica de la difusión en disco; como sabéis, consiste en impregnar discos de papel de filtro grueso con los extractos y colocarlos sobre placas de Petri inoculadas con un césped de una serie de bacterias de prueba.

Y nuestros experimentos dieron resultados negativos. No aparecieron halos de inhibición alrededor de los discos. Como tampoco observamos halos alrededor de los discos impregnados únicamente con etanol al 70%, el solvente que hemos usado para obtenerlos. Este era uno de nuestros controles. Si tampoco hubiese habido crecimiento alrededor de estos últimos, no hubiéramos podido saber si la capacidad antimicrobiana se debía a los extractos o al etanol. En cualquier caso, con estos resultados hubiésemos podido concluir que nuestros pimientos no contenían compuestos antimicrobianos o no en la concentración suficiente como para dar lugar a los halos. Y hubiéramos acabado ahí.

Si no fuese porque teníamos otro tipo de control.

Y este control era la propia capsaicina, la sustancia para la que se ha descrito carácter antimicrobiano en la litetratura. Paralelamente al experimento anterior estudiamos el carácter inhibidor de la capsaicina a una serie de concentraciones dadas y los resultados fueron... ¡igualmente negativos! Y habíamos ensayado concentraciones capaces de matar células humanas en cultivo, tal y como nos comentó José Manuel Palma en la sesión anterior. Las concentraciones ensayadas iban desde 10 micromolar a 1000 micromolar.

Pero ¿y si estas concentraciones eran demasiado bajas para detener el crecimiento de las bacterias? Era una posibilidad. Y la forma de comprobarlo era muy fácil: aumentar la concentración de capsaicina con la que impregnábamos los discos. Y probamos con concentraciones 50 veces superiores, desde 1,6 mM hasta 50 mM. ¡Y los resultados fueron igualmente negativos! La falta de halos de inhibición se puede ver en la imagen de abajo.

¿Sería un problema del diseño experimental? ¿De la forma de preparar las placas? ¿De si las bacterias que utilizamos son realmente buenas indicadoras? Paralelamente llevamos a cabo experimentos similares, con la misma metodología, con extractos de cáscara de granada. Como mostrábamos en el blog del proyecto y en la imagen de abajo, se observaban halos de inhibición notorios frente a todas las bacterias ensayadas. No debía ser un problema del protocolo empleado con los extractos de pimiento.

 

Halos de inhibición de extractos de granada sobre un cultivo de Escherichia coli. Control con los disolventes empleados para la extracción.

 

No obstante, decidimos cambiar la técnica. Ahora íbamos a probar la difusión en pocillo. Para ello, perforábamos y extraíamos un disco de agar de la placa inoculada con las bacterias, creando un pocillo en el depositábamos el volumen apropiado de extracto de pimiento e igualmente de capsaicina, ésta a una elevada concentración, 50 mM.

¡Y de nuevo hemos obtenido resultados negativos! Salvo un halo de inhibición que ha aparecido frente a Xanthomonas con el extracto de pimiento de la variedad Boiro, el resto de los extractos no muestra actividad, ni tampoco la capsaicina. ¿Y por qué aparece solo ante esta bacteria?

Como podemos ver, los misterios no son solo cosa de las novelas de intriga o de las películas. Nos enfrentamos a un auténtico misterio. ¿Por qué no observamos halos de inhibición con la capsaicina con ninguna de las técnicas que utilizamos? ¿Por qué ha desaparecido el efecto antimicrobiano de la capsaicina? Hay varias posibles explicaciones. Paula, una de las participantes en el proyecto, aportó una referencia bibliográfica en la que una cepa de la bacteria Xanthomonas era infectiva en un pimiento con alto grado de acrimonia y, por tanto, era de suponer que resistía a la capsaicina. Este tipo de resistencias se dan, pero no son demasiado frecuentes. ¿Vamos a tener cinco microorganismos resistentes simultáneamente a la capsaicina? Es muy poco probable. ¿Hemos alterado la capsaicina eliminado su actividad antimicrobiana? Podría ser ¿pero por qué los extractos de las variedades con más capsaicina tampoco dan halos de inhibición? Y así podríamos seguir haciéndonos más preguntas.

Como vemos, la ciencia nos aclara cosas pero a la vez nos despierta nuevos interrogantes. Si no surgieran éstos, probablemente no estaríamos participando del proceso científico a fondo, ni la humanidad hubiera avanzado tanto en la lucha contra las enfermedades ni en el desarrollo tecnológico. Y así las cosas, es ahora momento de emular al detective más famoso del mundo par resolver este auténtico misterio. Y al igual que él, no nos queda más remedio que recurrir a la ciencia. Como decía Sherlock Holmes: "Una vez descartado lo imposible, lo que queda, por improbable que parezca, debe ser la verdad". Pero con eso no bastará, tendremos que comprobarlo. Como hemos hecho con la capsaicina.

Germinación en medios salinos: resultados

Germinación de semillas de Vigna unciculata en una solución de CaSO4 0,1M a las 48 horas.

 

Iniciábamos los tratamientos con nuestras semillas el pasado 8 de febrero. A las 24 horas, no había germinado ninguna de ellas. A lo largo de estos días hemos podido constatar cómo las semillas de carilla (Vigna unciculata), han sido las primeras en empezar a germinar; después lo han hecho algunas de maíz (var 1). Las tablas de abajo muestran la cantidad de semillas puesta para cada tratamiento y el número que van germinando en las fechas indicadas. A partir de ellas iremos valorando los resultados y exponiendo nuestras conclusiones y propuestas en los comentarios.

Número de semillas sometidas a cada uno de los tratamientos señalados (8 febrero 2021)

Número de semillas germinadas para cada planta y tratamiento a las 48 horas del inicio del experimento (10 de febrero de 2021).

Número de semillas germinadas para cada planta y tratamiento a las 72 horas del inicio del experimento (11 de febrero de 2021)

Número de semillas germinadas para cada planta y tratamiento a las 96 horas del inicio del experimento (12 de febrero de 2021)

Primera sesión experimental

Esta mañana hemos iniciado los experimentos sobre la germinación de nuestras semillas. Hemos preparado las cámaras de germinación con recipientes de plástico de los utilizados para almacenar alimentos. Hemos dispuesto en la base una hoja doble de papel absorbente y sobre ella hemos depositado las semillas en la cantidad que se indica en la tabla siguiente:

 

Como adelantábamos en la entrada anterior, estudiaremos la germinación de nuestras semillas a lo largo de los días con distintos tratamientos salinos: con agua destilada, cloruro sódico 0,5M y 1M, clorato potásico 0,1M y 0,2M y sulfato de calcio 0,1M y 0,2M. Hemos tenido que modificar las concentraciones que indicábamos en la entrada previa de este blog dada la baja solublidad del KClO3 y del CaSO4. En este último caso no se ha podido conseguir la disolución total de la sal en el agua, por lo que se ha añadido en este estado, con la solución completamente saturada y una parte del compuesto sin disolver.

Puesto que nuestro objetivo es comprobar si Pseudomonas putida, nuestra bacteria de elección, tiene algún efecto protector frente a los medios con alta concentración salina, se han hecho dos lotes, uno de ellos con las semillas sin tratar y el otro con las semillas inoculadas. Para este último, se ha introducido las semillas en tubos falcon a los que se les ha añadido 1 ml de cultivo en fase estacionaria de P. putida más 19 ml de agua, de modo que todas las semillas quedasen cubiertas. Se han mantenido sumergidas en la suspensión bacteriana durante 15 minutos.

 

Las semillas se han colocado regularmente espaciadas en los recipientes. Se han utilizado dos tamaños de recipientes; uno más grande para Vigna unguiculata (dada la mayor disponibilidad de semillas) y otro más pequeño para el resto. A los recipientes grades se les ha añadido 60 ml de la solución de sales; a los pequeños se les ha puesto 40 ml. Seguidamente se han cubierto con un papel absorbente doble y se han cubierto con su tapadera.

El siguiente paso será valorar el número de semillas que va germinando a lo largo de los días durante el resto de la semana. Una vez obtenidos estos resultados se procederá a la comparación de los resultados de los distintos tratamientos. En la imagen de abajo nuestros recipientes con las semillas.

¿Cómo estudiamos el efecto de los medios salinos sobre la germinación de las semillas?

Comenzamos la fase experimental de nuestro proyecto. Nuestros primeros ensayos irán encaminados a determinar el efecto de los entornos salinos sobre la germinación de las plantas y a valorar el posible efecto protector de los microorganismos. Las plantas cuyas semillas estudiaremos serán la carilla, una alubia (Vigna unciculata), y dos variedades de maíz (Zea mays). Las sales cuyo efecto probaremos serán el cloruro sódico, el clorato potásico y el sulfato de calcio. Las concentraciones a ensayar se indican en la tabla adjunta. La bacteria cuyo efecto protector valoraremos es Pseudomonas putida.

Prepararemos dos lotes de recipientes para cada tipo de planta. En todos ellos se colocará una base con dos hojas de papel absorbente sobre la cual se dispondrán las semillas, un mínimo de 16 en cada recipiente. En el primer lote las semillas no llevarán tratamiento bacteriano y únicamente serán humedecidas con agua destilada (el control) y con las soluciones de las distintas sales y concentraciones.

El tratamiento microbiológico de las semillas se hará con Pseudomonas putida. Es la bacteria más apropiada en función de los datos que habéis aportado tras la revisión bibliográfica. Para inocular las semillas las colocaremos dentro de un tubo falcon y se les añadirá 1 ml de cultivo bacteriano diluido en 19 ml de agua. Dejaremos actuar durante unos 15 minutos. Después se dispondrán regularmente espaciadas sobre la base de papel absorbente que habíamos colocado en el fondo del recipiente, se cubrirán con una nueva capa de papel y se humedecrán con la cantidad suficiente de agua destilada o de las soluciones de distinta conentración salina que estamos probando. A lo largo de los días siguientes se contará el número de semillas germinadas a las 24, 48 y 72 horas y se calculará la proporción de éstas respecto al total usado para cada tratamiento. Los datos se plasmarán en tablas como la de arriba.  Finalmente se compararán las proporciones entre semillas germinadas para cada concentración salina en función de si han sido o no  tratadas con Pseudomonas putida.

Y ahora una pequeña tarea, que parece más propia de una clase de Química, pero que es totalmente necesaria en un laboratorio de Biología. ¿Qué cantidad de cada sal tendremos que pesar para preparar medio litro (500 ml) de cada una de las disoluciones con la concentración molar que indicamos en la tabla de arriba? Con el cloruro sódico (NaCl) y el clorato potásico (KClO3) los cálculos son simples. Sin embargo, el sulfato de calcio del que disponemos es dihidratado y responde a la fórmula CaSO4·2H2O, por lo que deberemos tener en cuenta la presencia de esas dos moléculas de agua para calcular la cantidad a disolver.

Bacterias terrestres, contaminantes marcianos

A lo largo de estos últimos cursos hemos desarrollado diversos proyectos de índole astrobiológica con el objetivo principal de valorar la posibilidad de que microorganismos terrestres pudieran sobrevivir en Marte o en algún exoplaneta lejano cuyas condiciones ambientales recordasen a las de nuestro planeta. Prentendíamos ver si hipotéticas formas de vida extraterrestres, suponiéndoles una fisiología semejante a la de nuestros microorganismos terrestres, tendrían posibilidad de habitar en esos lugares. Era una forma de valorar las condiciones que tendrían hipotéticas bacterias marcianas.

Hace unos meses presentamos en el V Congreso virtual de Astrobiología de Colombia, en una sección dedicada a Astrobiología y Educación, nuestra comunicación titulada "¿Podrían sobrevivir microorganismos terrestres en Marte? Una experiencia educativa con alumnado de secundaria. En ella discutíamos que otra posible implicación de nuestro trabajo era valorar la posibilidad -y esta es mucho más real- de que microorganismos terrestres pudieran contaminar otros mundos viajando en los instrumentos espaciales, en el caso de que éstos no hubiesen sido convenientemente esterilizados. Es algo sobre lo que también existe abundante literatura científica y sobre lo que se han llevado a cabo experimentos en la Estación Espacial Internacional.

Las implicaciones de todo esto son importantes. Pensemos en que si, por ejemplo, se quiere estudiar la presencia de vida en Marte o en la Luna, bien presente o pasada, nuestros hipotéticos polizones microscópicos podrían dar falsos positivos. Y esto incluso en el caso de que no sobreviviesen si lo que se detecta es la presencia de materia orgánica o cualquier otro biomarcador.

Perseverance (ilustración). Fuente: Wikipedia

 

Este 2021 se presenta como un año de oro en la exploración de Marte. Dentro de unos días llegará al planeta rojo Perseverance, un rover parecido a Curiosity con experimentos específicos para intentar conocer si en Marte hubo vida. Y será el primero, pero no el último de toda una serie de instrumentos lanzados por diversos países que en los próximos meses o años llegarán a Marte. Quizá por eso vuelva a tener interés lo relacionado con la posible contaminación de entornos extraterrestres. Una prueba de ello es este artículo que ha publicado recientemente el diario El País y que Manuel Espinosa nos recomienda: Las misiones espaciales privadas elevan el riesgo de contaminación biológica. 

Algunos también muy interesantes se pueden leer en la edición inglesa de The Conversation:

Colonizing Mars means contaminating Mars - and never knowing for sure if it has its own native life.

Mars: how scientist prevent Earth´microbes from contaminating other planets.

Con nuestros estudios acerca de la supervivencia de nuestras bacterias en ambientes simulados marcianos pretendíamos conocer cómo podría ser esa hipotética vida microbiana marciana, en el caso de que existiera o hubiese existido. Pero nuestros experimentos también aportan luz a algo que es tremendamente real, y es valorar la posibilidad de que, sin las medidas apropiadas, pudiéramos contaminar biológicamente con microorganismos terrestres aquellos mundos que queremos explorar y debemos preservar.